第一节 胆固醇测定
血清中胆固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下,可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。
1.化学法
化学法一般包括:①抽提;②皂化;③毛地黄皂苷沉淀纯化;④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法,通过①~④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法,现将此法作为标准参考方法予以引用。
2.酵法测定
CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA,TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法,快速准确,标本用量少,便于自动生化分析仪作批量测定。
一、Abell-Kendall改良法1.原理
血清加入醇溶性氢氧化钾,使胆固醇从脂蛋白中分离出来,同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇,加石油醚振摇、抽提,使胆固醇移入石油醚层,分离并取一定量的石油醚层,蒸发至干,再进行Liebermann-Burchard 显色反应,620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。
2.试剂组成
代号 | 种类 | 浓度 | 组 成 | 贮存2~8℃ | 有效时间 |
R1 | 乙醇 | 优质纯 | |||
R2 | 石油醚 | 沸点68℃,特级纯 | |||
R3 | 水醋酸 | 分析纯 | |||
R4 | 无水醋酸 | 胆固醇分析用,不含HCI | |||
R5 | 浓硫酸 | 分析纯 | |||
R6 | KOH液 | 33%(W/W) | KOH10g+H2O20ml | ||
R7 | 乙醇性KOH液 | R194ml+R66ml | 临用前配制 | ||
R8 | Liebermann | 配制后 | |||
Burchard | R420体积+R51体积+R310体积 | 1h | |||
试剂* | 内用完 | ||||
R9 | 胆固醇标准液 | 5.17mmol/L | 胆固醇标准品200mg+R1→100ml | 0 |
*:在三角烧瓶内,加入无水醋酸,于冰水中冷至10℃以下,再慢慢加入浓硫酸,混合,静置10min,又加冰醋酸混匀,备用。
3.操作
图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图
按图15-1操作。
4.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
二、酶法(CEH、COD-POD法)首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸,胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下,生成△4-胆甾烯酮和H2O2,再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下,生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
(一)手工测定法
1.试剂组成
代号 | 种类 | 浓度 | 组成 | 贮2~8℃ | 有效时间 |
Na2HPO4 | 50mmol/L | ||||
Na2H2PO4 | 50mmol/L | ||||
胆酸钠 | 3mmol/L | ||||
4-氨基安替比林 | 0.82mmol/L | ||||
R1* | ESPAS | 14mmol/L | 24h | ||
Carbowax-6000 | 0.17mmol/L | ||||
CEH | 33U/L | ||||
COD | 117U/L | ||||
POD | 6700U/L | ||||
R2 | 标准液 | 5.17mmol/L | 用异丙醇溶解胆固醇 |
*混匀,调pH至6.70±0.10(25℃),或购买试剂盒。酶以活性单位表示。
2.操作
按图15-2操作。
3.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
(二)自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
1.试剂组成
A液:CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液:COD、4-氨基安替比林等。
图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图
2.上机参数
项 目 | 参 数 |
方 法 | 终点法 |
波 长 | 双波长(540nm,700nm) |
反应温度 | 37℃ |
试剂A反应时间 | 2~3min |
试剂B反应时间 | 5~6min |
样本用量 | 3μl |
试剂A用量 | 250μl |
试剂B用量 | 120μl |
单位 | mmol/L |
3.操作过程
4.计算
以△A=A2-A1,根据同样处理之标准或质控物计算,打印结果。
5.注意事项
(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
(2)试剂在有效内2~8℃避光食保存。
(3)胆固醇含量超过200mmol/L,需用生理盐水稀释再测。