第一节 液体内沉淀试验
絮状沉淀试验为历史较久,又较有用的方法。该法要点是:将抗原与抗体溶液混合在一起,在电解质存在下,抗原与抗体结合,形成絮状沉淀物。这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响,因而产生了两种最适比例的基本测定方法。
(一)抗原稀释法
抗原稀释法(Dean-Webb法)是将可溶性抗原作一系列稀释,与恒定浓度的抗血清等量混合,置室温或37℃反应后,产生的沉淀物随抗原的变化而不同。表12-1系以牛血清白蛋白为例的实验结果。
表12-1Dean-Webb定量沉淀试验
管号 | 抗原 | 抗体 | 总沉淀量 | 反应过剩物 | 抗原沉淀量 | 抗体沉淀量 | 沉淀中Ab/Ag |
1 | 0.003 | 0.68 | 0.093 | Ab | 0.003 | 0.090 | 30.0 |
2 | 0.005 | 0.68 | 0.145 | Ab | 0.005 | 0.140 | 28.0 |
3 | 0.011 | 0.68 | 0.249 | Ab | 0.011 | 0.238 | 21.7 |
4 | 0.021 | 0.68 | 0.422 | Ab | 0.021 | 0.401 | 19.1 |
5 | 0.032 | 0.68 | 0.571 | Ab | 0.032 | 0.539 | 16.8 |
6 | 0.043 | 0.68 | 0.734 | - | 0.043 | 0.691 | 16.1 |
7 | 0.064 | 0.68 | 0.720 | Ab | - | - | - |
8 | 0.085 | 0.68 | 0.601 | Ag | - | - | - |
9 | 0.171 | 0.68 | 0.464 | Ag | - | - | - |
10 | 0.341 | 0.68 | 0.368 | Ag | - | - | - |
单位:mmol/L
从表12-1可以看出,1~5管为抗体过剩管,7~10管为抗原过剩管,唯第6管沉淀物最多,两者之比为16:1,即最适比。
(二)抗体稀释法(Ramon)法
本法采用恒定的抗原量与不同程度稀释的抗体反应,计算结果同上法,得出的是抗体结合价和最适比。
现今,为了取得抗原与抗体的最佳比例,已将以上两法相结合,即抗原和抗体同时稀释,称为棋盘格法(亦称方阵法),找出最佳配比。举例见表12-2。
表12-2方阵最适比测定
抗体稀释度 | 抗原稀释度 | ||||||||
1/10 | 1/20 | 1/40 | 1/80 | 1/160 | 1/320 | 1/640 | 1/12 | 对照 | |
1/5 | + | ++ | +++ | +++ | ++ | + | ± | - | - |
1/10 | + | ++ | ++ | ++ | +++ | ++ | + | - | - |
1/20 | + | + | ++ | ++ | +++ | ++ | + | - | - |
1/40 | - | ± | + | + | ++ | +++ | ++ | + | - |
1/80 | - | - | - | - | + | + | + | + | - |
“+”为沉淀物量:为最适比
从表12-2可以看出,方阵法可较正确地找出抗原与抗体的最适比。如抗体用1:40。抗原则按1:320稀释;如抗原是1:160,抗本则用1:20最为恰当。
二、环状沉淀试验环状沉淀试验是Ascoli于1902年建立的,其方法是:先将抗血清加入内径1.5~2mm小玻管中,约装1/3高度,再用细长滴管沿管壁叠加抗原溶液。因抗血清蛋白浓度高,比重较抗原大,所以两液交界处可形成清晰的界面。此处抗原抗体反应生成的沉淀在一定时间内不下沉。一般在室温放置10min至数小时,在两液交界处呈现白色环状沉淀则为阳性反应。本技术的敏感度为3~20μg/ml抗原量。环状试验中抗原、抗体溶液须澄清。该试验主要用于鉴定微量抗原,如法医学中鉴定血迹,流行病学用于检查媒介昆虫体内的微量抗原等,亦可用于鉴定细菌多糖抗原。因该技术敏感度低,且不能作两种以上抗原的分析鉴别,现已少用。